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「石蠟包埋組織切片（FFPE）＋ HRP/DAB 顯色」IHC
以下以最常見的「石蠟包埋組織切片（FFPE）＋ HRP/DAB 顯色」IHC 為主說明。IHC 的核心是：利用抗體辨識組織中的特定抗原，再透過酵素與顯色受質把抗原所在位置轉成可在光學顯微鏡下觀察的顏色訊號。
一、IHC 是什麼？能回答什麼問題？
IMMUNO HISTO CHEMISTRY
免疫組織化學染色（immunohistochemistry, IHC）將「抗原—抗體專一性結合」與組織形態學結合。它不只回答某蛋白是否存在，也能顯示它位於：
- 哪一類細胞（如腫瘤細胞、免疫細胞、血管內皮）
- 細胞的哪個區域（細胞核、細胞膜、細胞質、胞外基質）
- 分布型態與相對表現程度（瀰漫、局灶、強弱、陽性細胞比例）
臨床病理常用於腫瘤鑑別診斷、分類與伴隨診斷；研究上則常用於確認蛋白表現及其空間定位。IHC 結果必須與 H&E 形態、臨床資訊、陽性／陰性對照，以及經驗證的判讀標準一併解讀，不能只憑「有沒有棕色」下結論。
二、訊號如何從蛋白變成顏色？
典型 HRP/DAB 系統可簡化為：
組織抗原 → 一抗 → 二抗／聚合物偵測系統（帶 HRP） → DAB + H₂O₂ → 棕褐色沉澱
- 目標抗原：組織內欲偵測的蛋白或表位。
- 一級抗體（primary antibody）：專一辨識目標抗原。
- 二級抗體或聚合物（secondary antibody/polymer）：辨識一抗，並攜帶或招募多個 HRP 酵素，以放大訊號。
- HRP（horseradish peroxidase，辣根過氧化酶）：催化顯色反應。
- DAB（3,3′-diaminobenzidine）：在 HRP 與過氧化氫存在下氧化，於抗原位置形成不溶性棕褐色沉澱。
- 蘇木精（hematoxylin）復染：把細胞核染成藍紫色，讓組織結構與棕色訊號更容易定位。
常見替代系統是 AP（alkaline phosphatase，鹼性磷酸酶）＋紅色受質。若組織內源性過氧化酶較高或需多重染色，AP 系統可能有優勢；但每一種系統都需要分別最佳化與驗證。
三、FFPE-IHC 標準流程
1. 組織固定、脫水、石蠟包埋與切片
檢體通常以 **10% neutral buffered formalin（NBF，中性緩衝福馬林）**固定，再脫水、透明、浸蠟、包埋成石蠟塊，切成薄片並貼附於玻片。
原理與目的: 固定可停止自溶與腐敗、保留組織形態，但福馬林也會形成蛋白交聯，可能遮蔽抗體要辨識的表位。因此，固定時間(12~48hrs，室溫，15~20X Tissue volume)、組織厚度、固定液品質與冷缺血時間都會影響最終訊號。
關鍵觀念: 固定不足可能造成形態差、抗原流失；固定過久則可能使表位遮蔽過度、染色變弱。這也是 IHC 必須將前處理納入方法驗證的原因。
脫水dehygration: 脫水時酒精濃度由低至高70%~95%~100%~Xylene(完全移除水份)。
包埋embedding: Paraffin維持組織的完整性，包埋不理想的蠟塊會有縫隙(推薦Merck Histosec pastilles)。
切片sectioning: 3~4um，建議使用帶正電荷的玻片(Poly-L-lysine)
2. 烘片（baking）
切片通常先加熱，使組織更牢固附著在載玻片上。
目的: 避免後續高溫修復、洗滌或試劑處理時脫片。常用帶正電或矽烷處理玻片，也能增強附著力。可保持脂肪組織的完整性。
3. 脫蠟與復水（deparaffinization and rehydration）
石蠟切片依序經二甲苯或替代透明劑去除石蠟，接著用遞減濃度乙醇與水，使切片回到水相環境。
原理: 石蠟疏水，會阻礙水性抗體、緩衝液與染色試劑進入組織；脫蠟是讓後續反應得以發生的前提。
常用試劑
- 二甲苯（xylene）或替代品：溶解石蠟。
- 100%、95%、70% 乙醇：逐步移除透明劑、避免組織突然進水造成損傷。
- 去離子水、PBS 或 TBS：將切片帶入水性反應環境。
常見問題: 脫蠟不完全會導致染色不均、局部無訊號或背景異常。
4. 抗原修復／表位修復（Epitope retrieval）
這是 FFPE-IHC 最關鍵的最佳化步驟之一。固定造成的蛋白交聯會遮住表位，使一抗無法有效結合；抗原修復的目的，是重新暴露或恢復這些表位的可辨識性。Antigen retrieval guidance
主要有兩類：
熱誘導表位修復（HIER）
將切片置於緩衝液中加熱，例如使用壓力鍋、微波爐、水浴或自動染色機。
常見緩衝液：
- Citrate buffer，pH 6.0：較溫和，適用於部分抗原。
- EDTA／Tris-EDTA buffer，pH 8–9：較高 pH、作用通常較強，適用於另一些抗原。
原理: 高溫與適當 pH 有助於鬆動福馬林引起的交聯、改變蛋白構型，讓被遮蔽的表位重新暴露。
酵素誘導表位修復（PIER）
以蛋白酶 K、trypsin、pepsin 等消化部分蛋白質。
原理: 藉由有限度蛋白水解，移除遮蔽抗原的蛋白屏障。
注意: 修復不足會造成弱染或假陰性；修復過度則可能造成組織破壞、表位流失或背景上升。因此不能假設所有抗體皆適用同一種緩衝液、溫度與時間；應依抗體、組織、固定條件和檢測平台建立最佳條件(抗體的datasheet通常有建議最佳條件)。
Product Information (三合一去包埋試劑)
HyHisto 3in1 buffer 1L Cat# GB-IHCPT-1000
Deparaffinization、Rehydration and Epitope Retrieval 3in1
5. 封閉內源性酵素（常見為內源性過氧化酶）
若採 HRP/DAB 系統，常以 **H₂O₂（過氧化氫）**處理切片。
原理: 紅血球、嗜中性球、骨髓、脾臟、腎臟等組織可含較高的內源性過氧化酶。若未抑制，這些酵素也能催化 DAB 顯色，造成非目標性的棕色背景或假陽性。H₂O₂ 可使內源性過氧化酶失活。Multiplex IHC best-practices statement
常見試劑: 0.3–3% H₂O₂，溶於水、PBS 或甲醇；確切濃度與時間依平台套組及抗原而定。
注意: 過強或過久的處理可能影響部分抗原的染色強度；實務上要依抗體與組織評估。
**若使用 AP 偵測系統，則需考量 內源性鹼性磷酸酶，常以 levamisole 等抑制策略降低干擾。
6. 非專一性結合封閉（protein blocking）
HyBlock 3min Blocking Buffer in PBST 500mL Cat# GB-IHC3400
HyBlock 3min Blocking Buffer in TBST 500mL Cat# GB-IHC3401
原理: 組織內有帶電表面、疏水區域、Fc receptor，以及其他容易吸附抗體的位點。若不封閉，一抗、二抗或聚合物可能非專一性黏附，產生瀰漫背景。
重點: 封閉的目標是降低背景，不是「把所有組織都蓋住」。封閉過度或使用不相容成分，也可能削弱真實訊號。封閉是否有效，應透過陰性對照與背景情形判斷。
7. 一級抗體孵育 incubation
將針對目標抗原的一抗滴加於組織，通常在室溫短時間或 4°C 過夜overnight孵育。
原理: 一抗的 Fab 區域與目標抗原表位結合；抗體的專一性、親和力、濃度與孵育條件共同決定敏感度與背景。
常見稀釋液成分
- PBS 或 TBS：提供適當離子環境與 pH。
- BSA／serum／casein：降低非專一性吸附。
- Tween-20：降低表面張力與非專一性背景。
- 有時加入防腐劑（如 sodium azide）；但 azide 可能抑制 HRP，不適合直接與 HRP 偵測反應混用。
如何最佳化: 先以已知陽性組織進行抗體滴定：濃度太高常使背景升高；太低會使訊號弱或造成假陰性。最佳條件應呈現清楚、預期位置的特異性訊號，且背景可接受。
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8. 洗滌
通常使用 PBS 或 TBS，常含少量 Tween-20。
原理與目的: 移除未結合或鬆散結合的抗體／偵測試劑，降低背景並提升訊噪比。洗滌不足會造成背景髒；洗得過度或條件太強則可能損失弱結合訊號。
9. 二級抗體或聚合物偵測系統
依系統不同，可分為：
- 傳統二抗系統：二抗辨識一抗的物種與免疫球蛋白類型。
- Biotin–streptavidin 系統：biotinylated secondary antibody 與帶酵素的 streptavidin 結合，可放大訊號。
- Polymer system（聚合物系統）：以聚合物同時攜帶二抗結合位點與多個 HRP／AP 酵素，通常靈敏、步驟較少，也可避開部分內源性 biotin 干擾。
原理: 二級抗體或聚合物將「辨識一抗」轉換為「攜帶多個酵素」的偵測平台，使一個抗原位置能累積更多酵素，產生更明顯訊號。
內源性 biotin 問題: 在肝、腎、腦、乳腺等富含 biotin 的組織，biotin–streptavidin 系統可能產生非專一性背景；聚合物系統可作為常用替代方案。
10. 顯色（chromogen development）
HRP/DAB 系統中，加入 DAB 與 H₂O₂。
原理: HRP 催化 DAB 氧化，形成不溶於水與酒精的棕褐色沉澱，因此可保留在原位並完成後續脫水、封片。顯色時間越久，顏色通常越深，但背景也可能增加。
常見顯色劑
- DAB：棕褐色，最常見，耐酒精與二甲苯處理。
- AEC：紅色，但通常不耐有機溶劑，需水性封片。
- Fast Red／其他 AP 受質：紅色系，常用於 AP 系統。
安全提醒: DAB 常被視為具危害性的化學品；須依實驗室 SDS、通風、個人防護與廢液規範處理。
11. 復染（counterstaining）與藍化（bluing）
最常用 **hematoxylin（蘇木精）**將細胞核染為藍紫色。
原理: 蘇木精經氧化形成可與核內酸性成分（尤其 DNA／染色質）結合的染料複合物，使細胞核清楚可見。之後透過弱鹼性溶液或自來水「藍化」，使色澤轉為穩定藍色。
目的: DAB 顯示的是目標蛋白；蘇木精則提供細胞核與組織架構，讓判讀者能確認棕色訊號究竟位於何種細胞及何個區室。
12. 脫水、透明與封片
完成復染後，切片經遞增濃度乙醇脫水、二甲苯透明，再以樹脂性封片劑與蓋玻片封存。
原理與目的: 去除水分、使切片透明、保護染色結果並利於長期保存及顯微鏡觀察。
若採 AEC 等酒精不穩定的紅色顯色系統，通常不能使用一般酒精—二甲苯流程，而需採水性封片方式。
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四、對照組：IHC 是否可信的關鍵
IHC 不應只跑「待測切片」。至少應規劃：
| 對照類型 | 做法 | 主要用途 |
|---|---|---|
| 陽性組織對照 | 使用已知表現目標抗原的組織 | 確認抗體、修復、偵測與顯色系統有正常運作 |
| 陰性試劑對照 | 省略一抗，或以同型對照／非免疫 Ig 取代 | 偵測二抗、聚合物、內源性酵素或非專一性背景 |
| 陰性組織對照 | 使用理論上不表現目標抗原的組織 | 檢查抗體是否產生非預期交叉反應 |
| 內部陽性對照 | 同一張切片內本應陽性的正常細胞或結構 | 最理想，可反映該張切片與該次反應是否成功 |
陽性對照最好與待測檢體同批、同條件處理；若陽性對照不顯色，待測檢體的陰性結果通常不能直接視為真陰性。IHC performance overview
五、常見異常與優先排查方向
| 現象 | 常見原因 | 優先調整方向 |
|---|---|---|
| 完全沒有訊號 | 一抗失效或太稀、修復不合適、偵測試劑失效、抗原受固定破壞 | 先看陽性對照；確認抗體、修復 buffer、檢測系統與孵育條件 |
| 訊號太弱 | 修復不足、抗體濃度過低、孵育不足、顯色不足 | 強化或更換修復條件；抗體滴定；延長合理孵育或顯色 |
| 全片很髒／瀰漫背景 | 封閉不足、抗體太濃、洗滌不足、切片曾乾掉 | 降低一抗濃度；改善封閉與洗滌；保持切片濕潤 |
| 非目標部位呈棕色 | 內源性過氧化酶未封閉、抗體交叉反應、DAB 過度顯色 | 強化 H₂O₂ 封閉；驗證抗體；縮短顯色 |
| 切片脫落 | 玻片附著力不足、烘片不足、修復太劇烈 | 使用正電玻片；調整烘片與修復條件 |
| 核染過深而遮蔽訊號 | 蘇木精復染過久或分化不足 | 縮短復染、增加分化／藍化的適當控制 |
| 同批次結果不一致 | 前分析條件、抗體批次、溫度、修復或洗滌差異 | 固定 SOP、紀錄批號與時間、使用對照與標準化平台 |
六、全流程與試劑總整理
| 步驟 | 常用試劑／材料 | 原理 | 主要用途 | 重點風險或注意事項 |
|---|---|---|---|---|
| 固定 | 10% NBF | 形成交聯、保存組織形態 | 防止自溶、保存檢體 | 過久固定可遮蔽表位 |
| 包埋／切片 | 石蠟、正電玻片 | 石蠟支撐組織以製作薄切片 | 保存與切片 | 玻片附著不良會脫片 |
| 烘片 | 烘箱／熱板 | 加強組織與玻片附著 | 降低後續脫片 | 過度加熱可能影響部分抗原 |
| 脫蠟 | 二甲苯或替代品 | 溶解疏水石蠟 | 讓試劑能進入組織 | 脫蠟不完全會染色不均 |
| 復水 | 遞減濃度乙醇、水、PBS/TBS | 將切片由有機相轉回水相 | 準備抗原修復與抗體反應 | 避免流程中切片乾掉 |
| 抗原修復 | Citrate pH 6、EDTA/Tris-EDTA pH 8–9、proteinase K 等 | 鬆解交聯或有限蛋白消化以暴露表位 | 恢復抗原可辨識性 | 條件需對抗體／組織個別最佳化 |
| 內源性酵素封閉 | H₂O₂；AP 系統可用 levamisole | 使內源性 HRP 或 AP 失活 | 降低酵素性假陽性 | 太強可降低部分抗原訊號 |
| 蛋白封閉 | Normal serum、BSA、casein、商業 blocking reagent | 佔據非專一性吸附位點／降低 Fc 相關背景 | 降低背景 | 選擇須與偵測系統相容 |
| 一抗孵育 | Target-specific primary antibody | 抗體與目標抗原表位結合 | 提供分析特異性 | 抗體選擇與滴定是核心 |
| 洗滌 | PBS/TBS，常含 Tween-20 | 移除未結合試劑 | 提升訊噪比 | 洗滌不足易產生背景 |
| 二抗／聚合物 | HRP-或 AP-conjugated secondary、polymer reagent | 辨識一抗並攜帶／招募酵素 | 偵測與訊號放大 | 注意抗體物種、isotype 與內源性 biotin |
| 顯色 | DAB + H₂O₂；AEC；Fast Red | 酵素催化生成局部不溶性有色沉澱 | 將抗原位置可視化 | 顯色過久會加深背景；DAB 需依安全規範處理 |
| 復染與藍化 | Hematoxylin、藍化液或弱鹼性水 | 核染提供形態背景 | 協助定位與判讀 | 過深復染可能掩蓋訊號 |
| 脫水／透明 | 乙醇、二甲苯 | 去水、透明化 | 為封片與保存做準備 | AEC 等不耐酒精受質需改水性流程 |
| 封片 | 樹脂性或水性封片劑、蓋玻片 | 保護切片與顯色產物 | 長期保存與觀察 | 封片劑須與顯色系統相容 |
| 品質控制 | 陽性、陰性、內部對照 | 驗證整個檢測鏈 | 判斷結果是否可採信 | 對照異常時不可直接解讀樣本結果 |
最後可把 IHC 的品質概念濃縮成一句話：特異性主要來自一抗與正確對照；敏感度主要受固定、抗原修復與偵測系統影響；背景則主要受內源性酵素、非專一性結合、洗滌和顯色條件控制。
