何謂調節性 T 細胞（Regulatory T cells, Tregs）
調節性 T 細胞 (Tregs) 調節免疫系統，維持免疫平衡、對自身抗原的耐受性，並抑制過度免疫反應。若 Tregs 發育或功能異常，易引起發炎或自體免疫疾病；若過度活躍，則可能抑制腫瘤免疫反應，甚至影響感染防禦，因此 Tregs 是重要的治療標靶。
一、Tregs 的形成
- 胸腺來源型 Tregs (tTregs)
起源於胸腺胸腺細胞 (thymocytes)，從 CD4⁺ CD8⁻ 胞群分化而來。在胸腺中透過與 MHC II 呈現自身抗原的細胞互動而選擇發育出 Tregs，並啟動 FoxP3 的轉錄。 - 週邊誘導型 Tregs (pTregs)
由外周的常規 T 細胞，在抗原刺激下（無論是否有發炎）分化而成，並且逐漸啟動 FoxP3 的表達。這類 Tregs 在體內可占較大比例。 - 體外誘導型 Tregs (iTregs)
在體外實驗中，當 FoxP3⁻ 的 T 細胞在 TGF-β 的存在下被誘導表達 FoxP3，即稱為 iTregs。
二、Tregs 的功能
- 抑制輔助 T 細胞 (Helper T cells) 和 細胞毒性 T 細胞 (Cytotoxic T cells) 的活化、增殖與細胞激素生成，也能調控其他免疫細胞（如樹突細胞與 B 細胞）。FoxP3 突變會導致 Tregs 功能障礙，進而誘發類似 IPEX 的嚴重自體免疫症狀。
Tregs 透過下列多重機制執行抑制功能：
- 分泌抑制性細胞激素：TGF-β、IL-35、IL-10；
- 表達酶 CD39 和 CD73，產生抑制性細胞外腺苷 (adenosine)；
- 釋放Granzyme和Perforin，直接誘導效應細胞死亡；
- 高表達 CD25，搶奪微環境中的 IL-2，減少效應 T 細胞的增殖；
- 調控先天免疫細胞（包含樹突細胞、巨噬細胞與中性球）。
三、Tregs 在臨床與研究中的應用
- 治療潛力：多株多價性 (polyclonal) Treg 細胞療法已在臨床試驗中應用於自體免疫病與器官移植排斥反應，展現部分成效。唯一的挑戰是需大量細胞，以及可能引起非特異性免疫抑制。
- CAR-Treg 技術：將嵌合抗原受體 (CAR) 技術應用於 Tregs，使其可針對特定抗原執行免疫耐受，具有潛力應用於自體免疫疾病或異體移植治療。
四、研究與鑑定工具
Tregs 辨識與分選標誌：
- 經典標誌：CD4、CD25、FoxP3。
- 若不使用細胞核內染色，也能用 CD127 (IL-7R α 鏈) 的低表現來標記可存活分選的 Tregs。
- 功能活性的 Tregs 還可用 CD39 來分選。
- Helios 轉錄因子則在部分 FoxP3⁺ Tregs 中表達，與更強的抑制效能相關。
功能性抑制實驗 (suppression assays)：
- 可搭配流式細胞術進行。將 Tregs 與效應 T 細胞共培養，最後評估受影響的效應細胞（如增殖能力、細胞激素產生）來測試 Treg 抑制功能。
Treg、APC、DC (dendritic cell)、Teff、TH、CTL (Cytotoxin lymphocyte) 及 PD1、PDL1免疫細胞交互關係
1. 抗原呈現細胞（APC, dendritic cell 等）
- 透過 MHC II 與 TCR 活化 CD4+ T 細胞 (Teff)。
- 透過 MHC I 與 TCR 活化 CD8+ T 細胞。
- 受到 Treg 的抑制（CTLA-4、PD-1/PD-L1、IL-10、TGFβ），降低共刺激與發炎性細胞激素釋放。
2. CD4+ 效應 T 細胞 (Teff)
- 被 APC 活化後，會分泌 IL-2 幫助 CD8+ T 細胞 增殖與活化。
- 在缺乏調控的情況下，會促進免疫反應，導致強烈的發炎與組織損傷。
- 受 Treg 抑制：
- IL-10、TGFβ → 抑制 Teff 的增殖與功能。
- CTLA-4 與 PD-1/PD-L1 → 下調活化訊號。
3. CD8+ T 細胞 → 細胞毒性 T 細胞 (CTL)
- 在 IL-2 幫助下成熟為 CTL。
- CTL 釋放 Perforin 與 Granzyme → 導致 標的細胞 (Target cell) 凋亡/裂解。
- 受 Treg 抑制：
- Treg 透過 抑制性 cytokines (IL-10, TGFβ)、granzyme，以及 代謝干擾 (IDO, adenosine) 降低 CTL 殺傷能力。
4. 調節型 T 細胞 (Treg, CD4+CD25+FoxP3+)
- 表面分子：CTLA-4, PD-1, CD39, CD73。
- 功能：
- 抑制 APC：降低其活化 Teff 的能力。
- 抑制 Teff：限制發炎性細胞激素的分泌。
- 抑制 CTL：降低細胞毒性反應。
- Infectious tolerance：促使其他 CD4+ T 細胞轉化為 Treg，擴大免疫抑制效應。
5. PD-1 / PD-L1 的角色
- PD-1：抑制性受體，表現在 Treg 及活化的 Teff 上。
- PD-L1：常見於 APC、腫瘤細胞與其他免疫細胞。
- 作用：
- 當 PD-1 與 PD-L1 結合 → 阻斷 TCR 與 CD28 所傳遞的活化訊號，降低 Teff 與 CTL 的功能。
- 這個機制維持免疫耐受，避免過度免疫反應。
- 在腫瘤微環境中，腫瘤細胞常透過高表達 PD-L1 逃避免疫攻擊。
✅ 簡單總結：
- APC → 活化 CD4+ / CD8+ T cell。
- Teff (CD4+) → 分泌 IL-2 幫助 CD8+ T cell 成為 CTL。
- CTL → 釋放 perforin / granzyme 殺死目標細胞。
- Treg → 用 IL-10, TGFβ, CTLA-4, PD-1/PD-L1, granzyme, 代謝調控 抑制 APC、Teff、CTL。
- PD-1 / PD-L1 → 是免疫檢查點，抑制 T cell 活性，維持免疫耐受，但也可能被腫瘤利用。
| 來源細胞 | 作用對象 | 分子 / Cytokine | 功能效果 |
|---|---|---|---|
| APC | CD4+ T cell (Teff) | MHC-II + TCR、CD28-CD80/86 | 活化 CD4+ T cell |
| APC | CD8+ T cell | MHC-I + TCR、CD28-CD80/86 | 活化 CD8+ T cell |
| CD4+ Teff | CD8+ T cell | IL-2 | 促進 CD8+ T cell 增殖、分化為 CTL |
| CTL (CD8+) | Target cell | Perforin、Granzyme | 誘導標的細胞凋亡/裂解 |
| Treg | APC | CTLA-4、PD-1/PD-L1、IL-10、TGFβ | 降低 APC 的抗原呈現與共刺激能力 |
| Treg | CD4+ Teff | IL-10、TGFβ、CTLA-4、PD-1/PD-L1 | 抑制 Teff 增殖與分泌發炎性細胞激素 |
| Treg | CTL | Granzyme、IL-10、TGFβ、IDO、Adenosine | 抑制 CTL 殺傷功能 |
| Treg | 其他 CD4+ T cell | Cytokine milieu、細胞接觸 | 誘導轉化為新 Treg（Infectious tolerance） |
| PD-1 / PD-L1 軸 | 活化的 T cell (Teff/CTL) | PD-1 (T cell) – PD-L1 (APC/腫瘤) | 抑制 TCR/CD28 訊號，降低活化與效應功能 |
Cell markers
tTreg cells are characterized by expression of CD4, CD25 and FoxP3. Lack of surface CD127 (α-chain of IL-7R) can also be used to further improve characterization of Treg cells and, if applied without intracellular FoxP3 staining, to allow for sorting of living Tregs.15 CD39 can be used for isolation of functionally-active Treg cells.16 The transcription factor Helios is expressed in a large subset of FoxP3+ Tregs, and is associated with a more activated phenotype and a slightly higher suppressive capacity.17
| Surface marker | Alternative names | Location |
|---|---|---|
| CD3 | T3 | Surface |
| CD4 | T4 | Surface |
| CD25 | Interleukin-2 receptor subunit alpha, IL2RA, TAC antigen, TCGFR | Surface |
| CD39 | NTPDase 1, TPDase | Surface |
| CD45RA | GP180 | Surface |
| CD49d | VLA-4 α chain | Surface |
| CD73 | 5′-nucleotidase, NT5E, E5NT | Surface |
| CD152 | CTLA-4 | Surface |
| CD161 | NKR-P1A | Surface |
| CD185 | CXCR5 | Surface |
| CD223 | LAG-3 | Surface |
| CD357 | TNFRSF18, AITR, GITR | Surface |
| CD366 | TIM-3 | Surface |
| FoxP3 | Forkhead box P3 | Nucleus |
| Helios | IKZF2 | Nucleus |
Markers
| Specificity | Purpose | Clone | Fluorochrome | Laser | Filter |
| CD45 | Leukocyte gating | J33 | Krome Orange | 405nm | 525/40 |
| CD3 | T cell lineage | UCHT1 | APC-Alexa Flour 750 | 638 nm | 763/43* |
| CD4 | T Helper cell lineage | SFCI12T4D11(T4) | PE-Cy7 | 488 nm | 763/43 |
| CD25 | Treg cell lineage | B1.49.9 | PE | 488 nm | 585/42 |
| FoxP3 | Treg cell lineage | 259D | Alexa Flour 647 | 638 nm | 660/10 |
| Helios | Treg subset identification | 22F6 | Pacific Blue | 405 nm | 450/45 |
| CD45RA | T cell differentiation | 2H4LDH11LDB9(2H4) | FITC | 488 nm | 525/40 |
| CD39 | Treg suppression function | BA54 | PE-Cy5.5 | 488 nm | 690/50 |
DURAClone IM Treg Panel
概述
- DURAClone IM Treg 是一套預製好的乾燥抗體panel，可使用快速透化流程（fast permeabilization protocol），用於識別及表徵 FoxP3⁺ 調節性 T 細胞 (Tregs)。其乾燥配方改善工作流程效率與試劑穩定性。
- 面板包含 8 種標記，包括：
CD3, CD4, CD25, CD39, CD45, CD45RA, FoxP3, Helios，能強化 Treg 群體的識別。 - 該套件為單一化組裝（unitized assay），無需自行混合抗體、提升操作一致性。包括 25 次檢測，另附 3 套螢光補償試劑組 (compensation kits)
優點特色
- 專家設計抗原組合，涵蓋 FoxP3 以強化 Tregs 鑑定能力，且可額外加入 drop-in 標記以應對特殊研究需求。
- 省時省力：乾燥預製格式減少抗體 titration 和混合步驟的時間消耗，簡化庫存管理。
- 高度一致性：單一製備Tube 減少移液誤差，tandem 染料的批次穩定提升補償精準度。
- 使用便利：只需加入樣品，經incubation及wash即可上機，不需另外配製染色混合物。
技術與操作說明
- 每盒包含 25 次檢測用試管與 3 套補償 kit。補償 kit 各包含單色染料，包括：CD4-FITC、CD4-PE、CD39-PC5.5、CD4-PC7、FoxP3-Alexa Fluor 647、CD3-APC-Alexa Fluor 750、CD4-Pacific Blue、CD8-Krome Orange。所有 tandem 染料皆為配對批次。
- 官方建議的染色流程包含：
- 加入 50 µL 全血於 Tube 1 中，incubation（20–30 °C, 15 分鐘）
- wash and transfer into Tube 2、通透化及細胞內染色（使用 PerFix-nc kit）
- wash後使用 Buffer 3 重懸液至 500 µL，即可進行流式細胞儀讀取。
- 補償設置可透過單色補償 tube 搭配 VersaComp beads 進行，確保儀器補償精準。
- 建議使用 CytoFLEX 和 Kaluza 軟體分析，可依以下 gating 策略進行：
- Singlet → CD45⁺ → CD3⁺ → CD4⁺ → CD25⁺ FoxP3⁺ → 再依 CD45RA 和 Helios 分析 Treg 亞群。
