多色流式細胞術 · 免疫細胞分析
利用 CytoFLEX mosaic 光譜偵測模組優化多色流式細胞術 Panel
Optimizing a Multicolor Flow Cytometry Panel Using the CytoFLEX mosaic Spectral Detection Module for Immune Cell Analysis
作者｜Fanuel Messaggio、Anisha Jose、Krittika Ralhan
單位｜Beckman Coulter Life Sciences（美國邁阿密）、Beckman Coulter Life Sciences India Pvt Ltd（印度卡納塔克邦）
前言
Introduction ・ 光譜偵測模組的價值
CytoFLEX mosaic 光譜偵測模組結合傳統與光譜偵測方法，強化 CytoFLEX 儀器的功能。此模組能偵測更廣泛的標記與細胞亞群，特別適合樣本量有限的研究。本研究設計一組完整的流式細胞術 panel，用於鑑定免疫細胞亞群，重點在於 T 細胞的活化與分化。
此 panel 搭配 CytoFLEX LX 流式細胞儀與 CytoFLEX mosaic 88 光譜偵測模組，包含 22 種顏色與 23 個標記。panel 中含有光譜重疊嚴重的螢光物質（如 APC 與 Alexa Fluor 647），並導入新的紅外光染劑 IR820 與 IR870，以提升整體表現。
The panel was designed to immunophenotype immune cell subsets with overlapping fluorophores such as APC and Alexa Fluor 647, and introduces the IR dyes IR820 and IR870 to enhance performance.
實驗方法
Methods ・ 全血樣本與染色流程
樣本與前處理
- 以全血細胞為樣本，染色前以紅血球裂解液處理
- 準備 23 管流式管：22 管單色對照與 1 管全染色混合樣本
- 以 Fc 阻斷劑於避光條件下作用 20 分鐘
染色與清洗
- 依序加入抗體，先加 SuperNova Buffer
- 加入單核球阻斷劑後，不再額外培養
- 避光於室溫培養 30 分鐘，以染色緩衝液清洗兩次後重懸
Versa-Comp 單色對照
- 每管加入一滴陽性微球與對應抗體
- 避光室溫培養 15 分鐘後，清洗兩次並重懸
抗體 Panel 設計
Table 1 ・ Antibody Panel Details
| 標記 Marker | Clone | 螢光物質 | 用量 | 功能／用途 |
|---|---|---|---|---|
| CD27 | L128 | BUV395 | 5 µL | T 細胞活化表型 |
| CD33 | D3HL60.251 | SNv428 | 5 µL | 單核球 |
| CD19 | B49213 | PacBlue | 5 µL | B 細胞譜系標記 |
| CD4 | 13B8.2 | PacBlue | 5 µL | CD4+ T 細胞譜系標記 |
| CD8 | B9.11 | KrO | 5 µL | CD8+ T 細胞譜系標記 |
| CD38 | LS198-4.3 | SNv605 | 5 µL | T 細胞與 NK 細胞活化 |
| CD25 | B1.49.9 | SNv650 | 5 µL | T 細胞、Treg 鑑定 |
| HLA-DR | IMMU357 | SNv786 | 3 µL | 譜系標記（原文標示為 γδ T 細胞） |
| CD183（CXCR3） | GO25H7 | AF488 | 5 µL | T 細胞遷移 |
| CD45RO | UCHL1 | RB545 | 5 µL | T 細胞初始／記憶型區分 |
| CD16 | 3G8 | ECD | 5 µL | 單核球譜系標記 |
| CD45 | 2D1 | PerCP | 5 µL | 泛造血標記 |
| CD197（CCR7） | G043H7 | PE | 10 µL | T 細胞初始／記憶型區分 |
| CD11b | ICRF44 | AF594 | 5 µL | 樹突細胞與單核球 |
| CD127 | R34.34 | AF594 | 5 µL | T 細胞、Treg 鑑定 |
| CD279（PD-1） | PD.1 | PC5.5 | 5 µL | T 細胞活化與分化 |
| CD196（CCR6） | B-R35 | PC7 | 5 µL | B 細胞與部分 T 細胞 |
| CD23 | 9P25 | APC | 5 µL | B 細胞與單核球 |
| CD56 | 1H11 | AF647 | 5 µL | NK 細胞 |
| CD45RA | 2H4LDH11LD89 | AF700 | 5 µL | T 細胞初始／記憶型區分 |
| CD3 | UCHT1 | APC-A750 | 5 µL | 泛 T 細胞譜系標記 |
| CD20 | — | IR820 | 10 µL | B 細胞譜系標記 |
| CD14 | — | IR870 | 10 µL | 單核球譜系標記 |
Clone 與螢光物質以原文為準；標記名稱依原文呈現。
門控策略
Gating Strategy ・ 由碎片到細胞亞群的逐步篩選
門控以去除雜訊、辨識雙細胞與區分碎片為基礎，再將 CD45+ 白血球（全部白血球）與碎片分開。CD45+ 細胞進一步分為顆粒球、單核球與淋巴球（包含 B 淋巴球與 T 淋巴球）。
Step 1 · 排除雙細胞
FSC-A vs FSC-H 偽彩色圖，排除細胞雙聯體或聚集物。
Step 2 · 去除碎片
SSC-A vs FSC-A，碎片通常前向散射較低、側向散射較高。
Step 3 · 白血球分群
CD45 vs SSC-A 點圖，標示 CD45+ 白血球的各亞群。
單核球
CD14 vs CD16 點圖。
顆粒球（嗜中性與嗜酸性）
CD16 vs CD45 PerCP 點圖。
T 細胞與 NK 細胞
CD3+CD4+ T 細胞以 HLA-DR vs CD11b 點圖分析；NK 細胞以 CD56 vs CD16 點圖門控。
結果
Results ・ 相似性指數與光譜訊號
本 panel 中螢光物質的相似性指數分析，得到的複雜度分數為 11.0（由 CytExpert for Spectral 軟體產生）。
圖 2A 顯示門控策略能有效辨識各種細胞亞群；圖 2B 則呈現每種螢光物質在去疊加後的光譜特徵，並包含未染色樣本的自體螢光訊號。資料以 Poisson hybrid 演算法進行去疊加。
The panel was unmixed with the Poisson hybrid algorithm. Figure 2A shows all key leukocyte populations were identified, and Figure 2B shows the post-unmixing spectral signature of each fluorochrome.
摘要 Summary
本研究展示 CytoFLEX mosaic 光譜偵測模組可處理 23 色 panel。Poisson hybrid 去疊加演算法能有效區分重疊的顏色，搭配自體螢光提取與對照定義功能，以及易於操作的 CytExpert for Spectral 軟體，讓光譜實驗的去疊加更精確、流程更順暢。研究團隊成功辨識所有主要白血球族群及其亞群，顯示此系統在細胞族群分析上的效能與可靠性。
光譜去疊加讓高複雜度 panel 在有限樣本中仍能完整分析
Spectral unmixing enables complex panels to be analyzed from limited samples.
資料來源｜Beckman Coulter Life Sciences，2025-GBL-EN-107751-v2
僅供研究使用（For Research Use Only），不適用於診斷程序。
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