晶片設計與特色

NanoCoulter 採用了全球首創的固體晶片奈米孔顆粒分析平台，其晶片具備以下特點：

1. 矽基固態奈米孔技術： 結合十餘年的微米與奈米加工技術，採用光刻矽基固態奈米孔，成功將傳統的庫爾特檢測技術範圍從「微米級」下探至「奈米級」。
2. 不同量程選擇： 晶片具有不同的測量量程設計（例如 60–200 nm 或是 150–500 nm 等），可根據需求測量不同粒徑區間的外泌體或奈米顆粒。
3. 可拋棄式與非侵入式設計： 晶片被設計為「可拋棄型非侵入式檢測卡」，測量前後不需要清洗儀器和樣本槽，樣本直接上機即可進行測試，避免了交叉污染。
4. 智慧化設定： 晶片上預製有二維碼（QR Code），使用者只需掃描二維碼即可自動完成所有的參數設置，達到免校準的「傻瓜式」操作。

二、為什麼 Nanocoulter 適合 外泌體EVs 與奈米顆粒分析？

外泌體與細胞外囊泡具有高度異質性。即使同一批樣品中，也可能同時存在 50 nm 小型 EV、100-200 nm vesicles、蛋白聚集體、脂蛋白、細胞碎片與大顆粒污染。Nanocoulter 的優勢在於它是 single-particle counting，也就是逐顆計數，而不是只看整體平均訊號。

它特別適合以下用途：

• EVs / exosomes 的粒徑與濃度分析
• SEC、超速離心、沉澱法、TFF 後的樣品品管
• Liposome、LNP、polymeric nanoparticles 粒徑監控
• 病毒、VLP、疫苗顆粒分析
• 蛋白質聚集體與奈米污染物偵測
• 製程開發中的批次一致性比較

在研究實務上，Nanocoulter 的價值通常不是取代所有方法，而是提供與 NTA、DLS、TEM、nano-flow cytometry 互補的定量資訊。特別是當研究者想知道「每 mL 到底有多少顆粒」與「是否有少量大顆粒污染」時，RPS 類技術常能提供很直觀的答案。

三、Nanocoulter 類機型與技術比較

類型 / 機型概念	代表技術	主要特徵	適合樣品	優點	注意事項
傳統 Coulter counter	電阻脈衝感測	固定孔徑，主要用於細胞或較大顆粒	細胞、微米級顆粒	原理成熟、計數穩定	對奈米級 EV 靈敏度不足
MRPS 微流道式 Nanocoulter	Microfluidic RPS	使用微流道與固定感測孔	EVs、病毒、LNP、奈米顆粒	可逐顆計數，較不受折射率影響	需選擇合適孔道尺寸，避免堵塞
TRPS 可調式 Nanocoulter	Tunable RPS	nanopore 可拉伸調整，常見於 qNano、Exoid 類平台	EVs、liposome、virus、VLP	可量粒徑、濃度，部分系統可估 zeta potential	操作參數需最佳化，校正粒子很重要
自動化 TRPS / 新一代平台	半自動或自動壓力、電壓、孔徑控制	降低人為調機差異	多批次 EV 或製程樣品	重現性較佳，適合品管	成本較高，耗材與孔道規格需評估
NTA 光學追蹤系統	Nanoparticle Tracking Analysis	以雷射散射與布朗運動推算粒徑	EVs、病毒、奈米材料	可直接觀察顆粒影片，操作直覺	受折射率、光散射強度、背景雜訊影響

四、Nanocoulter 相較於 NTA 的優勢

NanoCoulter 相較於 NTA 的優勢

比較項目	NTA（光學式）	NanoCoulter（RPS 電阻脈衝式）
偵測原理	雷射照射顆粒，依布朗運動軌跡換算粒徑（屬光學散射法）	顆粒通過奈米孔道造成電阻變化，依物理體積換算粒徑
對折射率的依賴	偵測訊號強度受顆粒折射率影響，低折射率顆粒（如脂質囊泡）易被低估或漏偵	不依賴光學折射率，量測結果與顆粒真實體積直接相關，與 SEM 結果高度一致
小顆粒解析度	受光學繞射極限限制，對 <100 nm、尤其 <50 nm 顆粒解析力有限	部分機型可解析至 15–20 nm，對 AAV、外泌體小族群更敏銳
異質樣本處理	大顆粒散射訊號強，易掩蓋小顆粒訊號，造成粒徑分布偏移	逐顆通過孔道獨立計數，不受其他顆粒散射訊號干擾，異質樣本分布更真實
濃度量測準確性	受顆粒布朗運動軌跡追蹤品質、進樣濃度影響，重複性與線性度相對受限	濃度與脈衝頻率直接對應，線性關係佳（R² 常 >0.99），批次間變異係數（CV）可低於 5%
Zeta 電位量測	多數機型僅能取得樣本整體（系綜平均）Zeta 電位	可同步取得單顆粒層級 Zeta 電位，呈現族群異質性
與電子顯微鏡（TEM/SEM）一致性	因光學原理限制，與 TEM 數據常有系統性偏差	MISEV 2023 指引中亦提及 RPS 與 TEM 數據具高度一致性，適合作為正交驗證方法

NanoCoulter 與 NTA（奈米粒子追蹤分析）的量測結果在粒徑大小與濃度數值上有著顯著的差異，具體比較如下：

1. 粒徑結果差異（NTA 嚴重偏大）：
   • NTA： 測量出的平均粒徑通常會顯著偏大，甚至可達 NanoCoulter 測量結果的 2 倍。這主要是因為 NTA 的光學原理會受到樣本均一度的影響，在大小不一的多分散系樣本中，大顆粒的光學訊號會遮擋小顆粒的訊號，導致小顆粒的資料遺失，進而拉高了整體的平均粒徑。
   • NanoCoulter： 採用電阻脈衝感應（RPS）原理，顆粒是一顆一顆通過奈米孔洞被記錄。大小顆粒之間完全不會互相影響，能夠精準測量出樣本中大囊泡與小顆粒的真實比例，其測出的粒徑分佈與冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）的觀測結果完美吻合。
2. 濃度結果差異（NTA 嚴重偏小）：
   • NTA： 測得的顆粒濃度嚴重偏低。有國際期刊的同行評審（Reviewer）明確指出，NTA 在評估細胞外囊泡（EVs）的大小和濃度時非常不準確，因為它往往只能看到大於 80 nm 的顆粒，而這最多只佔了總顆粒數的 30% 不到，漏失了大量小顆粒的數據。
   • NanoCoulter： 由於能確實捕捉到極微小顆粒的訊號，不僅能找回被 NTA 遺漏的 70% 以上小顆粒數據，還能提供精密且重複性極佳的濃度定量結果。

總結來說，NTA 容易因為大顆粒的「遮蔽效應」產生**「粒徑偏大、濃度偏小」**的誤差；而 NanoCoulter 則能真正實現不受干擾的「單顆粒檢測」，在精確度與高解析度上皆優於 NTA

五、實驗操作上的建議

使用 Nanocoulter 分析 EVs 或奈米顆粒時，樣品前處理非常重要。建議先以低速離心或 0.22 μm / 0.45 μm 過濾去除大顆粒污染，但要注意過濾可能造成 EV 損失。若樣品來自血漿、血清或細胞培養上清，最好搭配 SEC 或 TFF 進行純化，降低蛋白質、脂蛋白與鹽類背景的干擾。

六、結論

NanoCoulter 所採用的電阻脈衝感測技術，透過奈米孔道直接偵測顆粒體積變化，跳脫了光學散射法對折射率與繞射極限的限制，特別適合 AAV、外泌體、LNP 等需要高解析度與高準確度定量的應用場景。對於正在進行 EVs 分離方法比較、病毒滴定、或奈米藥物製劑品管的研究團隊而言，將 NanoCoulter 與 TEM 等方法搭配作為正交驗證（orthogonal validation），有助於建立更穩健、更貼近真實顆粒分布的數據基礎。

Nanocoulter 類儀器最大的特色，是把奈米顆粒分析從「光學觀察」轉為「電訊號計數」。對 EVs、外泌體、病毒、LNP 與 liposome 研究而言，它能提供更直接的單顆粒濃度與粒徑分布資訊，尤其適合用於純化流程優化、製程品管與批次比較。

不過，Nanocoulter 並不是萬能工具。若研究目標是辨識特定表面標誌，例如 CD9、CD63、CD81、EpCAM 或腫瘤來源 EV，仍需要搭配 CytoFLEX nano flow cytometry、ExoView、Western blot、ELISA 或質譜分析。最理想的策略，是把 Nanocoulter 用於粒徑與濃度定量，再搭配免疫標記與蛋白質分析確認顆粒來源與生物學意義。

七、Zeta 電位檢測（電泳法）：

在電解質中，儀器會測量顆粒穿過奈米孔的時間（即電阻脈衝訊號的寬度），結合顆粒運動的距離來計算「電泳遷移率」，接著套用 Henry 方程與 Helmholtz-Smoluchowski 模型，準確計算出單顆粒的 Zeta 電位

NanoCoulter 計算 Zeta 電位是基於電泳法的原理，具體的計算過程如下：

1. 測量過孔時間：在電解質環境中，儀器會精確檢測單個顆粒穿過奈米孔洞所需的時間，這在數據上表現為「電阻脈衝訊號的寬度」。
2. 計算電泳遷移率：透過該過孔時間，並結合顆粒運動的距離，儀器會先計算出顆粒的「電泳遷移率」。
3. 套用物理公式：接著，系統會根據 Henry 方程與 Helmholtz-Smoluchowski 模型進行換算，最終準確得出該單顆粒的 Zeta 電位數值。

透過這種方式，NanoCoulter 能夠在測量單顆粒粒徑的同時，同步完成 Zeta 電位的精確分析

Zeta 電位數值的「正負號」與「大小」分別代表不同的物理意義，具體說明如下：

1. 正負號代表「表面電荷的極性」： Zeta 電位的正負取決於顆粒（如奈米顆粒或外泌體）表面所帶的淨電荷。在 NanoCoulter 的測量原理中，儀器會施加外加電場，帶電顆粒會向著「相反電荷」的電極移動。
   • 負值（-）： 代表顆粒表面帶有淨負電荷，在外加電場的作用下會向正極移動。在實際的生醫觀測中，大多數天然的細胞外囊泡（如紅血球細胞膜囊泡 RBCVs、桔梗或人參來源的類外泌體等）通常表面帶負電，測出的 Zeta 電位多為負值（例如資料案例中顯示約為 -25 mV 或 -28.38 mV）。
   • 正值（+）： 代表顆粒表面帶有淨正電荷，在外加電場下會向負極移動。
2. 數值的絕對值代表「系統的穩定性」： 若要判斷樣本是否容易發生團聚，主要看的是 Zeta 電位的「絕對值」而非正負號。無論是帶正電還是帶負電，只要電位的絕對值越高，代表粒子之間的靜電排斥力就越大，顆粒就越不容易互相靠近而發生聚集或沉澱，這代表該分散體系的穩定性越好。

總結來說，Zeta 電位的正負號單純指示了顆粒在溶液中所帶電荷的種類（正電或負電），而數值的絕對值大小才是決定並量化系統穩定程度的關鍵指標

八、如何透過 Zeta 電位判斷外泌體的樣本穩定性？

在外泌體（細胞外囊泡，EV）分析中，Zeta 電位數據主要應用於評估外泌體的穩定性以及輔助藥物遞送系統的研發與製程優化。具體的應用面向包含以下幾點：

1. 評估外泌體系統的穩定性： Zeta 電位是衡量顆粒（外泌體）之間相互排斥或吸引強度的重要指標。Zeta 電位的絕對值越高，代表外泌體粒子之間的排斥力越大，代表該分散體系的穩定性越好。例如，研究人員透過量測桔梗來源 EVs 的粒徑和 Zeta 電位，成功證明其具有良好的穩定性，顯示其在三陰性乳腺癌治療中的潛力。
2. 評估不同分離方法的品質與效率： 在進行外泌體純化時，可以利用 Zeta 電位數據，搭配粒徑和濃度分析，來綜合評測不同外泌體分離方法（例如超高速離心法 UC、超濾法 UF、膜親和法 MA、尺寸排阻色譜法 SEC 以及聚合物沉澱法 PP）的提取品質與產出特徵。
3. 研發靶向藥物遞送系統： 在開發工程化外泌體作為藥物載體時，Zeta 電位是確認載體特性的關鍵參數。例如，在研發腦靶向的藥物遞送系統時，研究人員會觀測裝填大麻二酚（CBD）的工程化外泌體之粒徑與 Zeta 電位分佈，以確認其理化性質。
4. 優化製備與成藥過程： Zeta 電位數據可為外泌體或仿生奈米囊泡的製備工藝提供指標。以紅血球細胞膜囊泡（RBCVs）的抗癌研究為例，研究團隊藉助 RPS 技術表徵其粒徑分佈及 Zeta 電位，藉此成功優化了 RBCVs 的製備及成藥過程，實現對頭頸癌腫瘤細胞的靶向藥物遞送與釋放

外泌體（細胞外囊泡）的 Zeta 電位數值會因為細胞來源以及分離純化方法的不同而有所差異。一般來說，天然外泌體的表面多帶有淨負電荷，其測得的 Zeta 電位數值通常落在 -10 mV 至 -30 mV 左右的範圍。

總結來說，多數外泌體樣本的 Zeta 電位呈現負值，主要集中在 -10 mV 到 -30 mV 之間。一如先前所述，這個數值的絕對值越靠近甚至大於 20~30 mV，就代表外泌體粒子間的排斥力越強，樣本的分散狀態與穩定性也就越好。

九、NanoCoulter 與冷凍電顯的結果吻合度如何？

NanoCoulter 的量測結果與冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）以及穿透式電子顯微鏡（TEM）的觀測資料具有極高的一致性（完美吻合）。具體吻合度與實證如下：

1. 國際權威指南背書： 國際細胞外囊泡學會發布的最新指南《MISEV 2023》中明確指出，基於電阻脈衝感應（RPS，即 NanoCoulter 的技術原理）的測量結果，確實與電子顯微鏡（TEM）的數據具有非常高的一致性（very high concordance with TEM data）。
2. 外泌體粒徑分佈的完美對應： 在實際的外泌體樣本觀測中，透過冷凍電顯（Cryo-EM）可以觀察到樣本的粒徑分佈較廣，絕大部分的小顆粒集中在 60~90 nm之間，但同時也混雜著約 200 nm 的大囊泡。NanoCoulter 因為是真正的單顆粒逐個檢測，大小顆粒互不干擾，其測量出的平均粒徑為 81 nm，能精確還原與冷凍電顯統計高度一致的真實粒徑分佈。
3. 對比 NTA 的嚴重失真： 面對同樣的樣本，NTA（奈米粒子追蹤分析）因為大顆粒的光學訊號會遮擋小顆粒，導致測量出的平均粒徑飆高至 133 nm，這與冷凍電顯所見的真實情況差異極大。

總結來說，NanoCoulter 不須透過光學推算，而是直接測量顆粒的真實體積，這讓它的準確度能夠媲美電子顯微鏡，所呈現的單顆粒表徵與電顯的統計資料完美吻合

十、細胞外囊泡EVs的精準診斷與中醫治療

十一、NanoCoulter各機型比較表

以下整理目前 NanoCoulter 系列主要機型的定位與規格特色，方便依研究需求選型（實際規格請以原廠最新公告及實機驗證為準）：

機型	粒徑偵測範圍	濃度偵測範圍	核心特色	適用樣本
NanoCoulter Gauge	50 – 2000 nm	約 2×10⁶ – 3×10¹¹ particles/mL	同步量測粒徑、濃度、單顆粒 Zeta 電位，覆蓋範圍最廣	EVs／外泌體、LNP、病毒、奈米材料
NanoCoulter Vertex	15 – 60 nm	約 10¹⁰ – 10¹² particles/mL	突破 20 nm 偵測極限，精度可比擬電子顯微鏡（SEM）	AAV、小型 VLP
NanoCoulter Vertex Pro	涵蓋更寬廣的小顆粒範圍	視機型設定	在 Vertex 基礎上擴大粒徑範圍，同步量測粒徑、濃度與 Zeta 電位	AAV、sub-50 nm 顆粒
NanoCoulter Exact	偵測範圍極寬	視機型設定	強調快速量測，適合大範圍粒徑分布樣本的高通量篩查	多樣化奈米顆粒、製程監控
NanoCoulter Deft	視機型設定	視機型設定	同步取得粒徑與對應之單顆粒 Zeta 電位數據	穩定性／聚集性研究
NanoCoulter Scale	視機型設定	視機型設定	機型輕巧、性價比高，適合快速粒徑與濃度篩查	常規品管、教學與初篩用途

十二、文獻發表