什麼是Q-PCR ?
qPCR，全稱為「定量聚合酶連鎖反應」（quantitative Polymerase Chain Reaction），有時也被稱為「即時 PCR」（real-time PCR）。
其基本原理是：在進行 DNA 擴增的過程中，即時監測並記錄每一輪擴增所產生的產物量。這個過程是透過螢光染料或專一性探針的螢光訊號來反映 DNA 的擴增情形。
當螢光訊號達到一定的「閾值」（threshold）時，系統便可以根據擴增曲線回推原始模板的數量，從而達到對目標 DNA 進行定量分析的目的。
簡單來說，qPCR 是一種能夠在擴增過程中同步偵測螢光訊號的技術，使我們能夠準確得知樣本中含有多少目標核酸。
以下是常用於 qPCR（定量聚合酶連鎖反應） 中的 螢光染料與專一性探針的主要種類列表，並依照使用類型分類：
🔹 一、螢光染料（Fluorescent Dyes）
這類染料會與雙股 DNA 結合，並隨著產物量增加而產生更強的螢光訊號，屬於「非專一性檢測」方式。
| 名稱 | 發射顏色 | 特點與用途說明 |
|---|---|---|
| SYBR Green I | 綠色 | 最常用的 DNA 結合染料，價格低，靈敏度高，但無法區分特異與非特異擴增。 |
| EvaGreen | 綠色 | 新一代染料，靈敏度更高，毒性較低，且對 PCR 抑制性較小。 |
| SYTO 9 | 綠色 | 可用於部分定量分析，但背景較高。 |
備註：螢光染料雖然使用方便，但無法區分不同目標序列，容易受到非特異性擴增與引子二聚體 (Primer dimer )干擾。
🔹 二、專一性螢光探針（Fluorescent Probes）
這類探針能與特定的目標序列結合，提供更高的專一性，適用於多重檢測與準確定量。
1. TaqMan 探針（最常見）
- 結構：5′ Reporter dye + 中間探針序列 + 3′ Quencher
- 原理：Taq 酶在延伸時具核酸酶活性會切解探針，釋放 Reporter，產生螢光
| Reporter 染料 | 常用 Quencher | 顏色 | 備註 |
|---|---|---|---|
| FAM | BHQ-1、TAMRA | 綠色 | 最常見，靈敏度高 |
| VIC | BHQ-1、BHQ-2 | 黃綠色 | 可與 FAM 搭配做雙重檢測 |
| NED | BHQ-2 | 橘色 | 發射波長高，可避開 FAM/VIC干擾 |
| ROX | BHQ-2、BHQ-3 | 紅色 | 有時作為內參校正 |
| Cy5 | BHQ-3 | 深紅／近紅外光 | 適合多重 qPCR |
2. Molecular Beacon 探針
- 結構：形成髮夾環狀的 DNA 探針，5′ 與 3′ 分別有 Reporter 與 Quencher
- 原理：與目標序列互補時打開髮夾結構產生螢光，不結合時無螢光
- 特點：螢光背景低，專一性高，但設計較複雜
3. Scorpion 探針
- 結合引子與探針於同一分子，延伸後立即偵測
- 專一性與速度佳，但不利於多重檢測與通用設計
4. FRET 探針（Fluorescence Resonance Energy Transfer）
- 兩個探針分別標記不同螢光基團
- 兩探針同時結合在目標序列時產生能量轉移與螢光
- 應用於 Roche LightCycler 平台較多
🔬 TaqMan Probe 是什麼？
TaqMan 探針是一種用於即時定量 PCR（qPCR）中，以螢光原理解讀反應結果的 專一性探針系統。它由一段短寡核苷酸（通常 20–30 個鹼基）構成，具有：
- 5′ 端螢光報導分子（Reporter dye）
- 3′ 端螢光抑制分子（Quencher dye）
當探針完好時，報導分子的螢光會被抑制。當 Taq DNA polymerase 進行延伸，具有 5’→3’ 外切酶活性（exonuclease activity）會分解探針，導致報導分子脫離抑制而釋放螢光。
🔁 機制圖解（簡述流程）
- 引子結合與探針雜交：引子與模板 DNA 配對，TaqMan 探針也與中間區域互補結合。
- 延伸與切割：Taq 聚合酶從引子起始合成新鏈，並在遇到探針時進行切割。
- 螢光產生：探針被切開後，報導分子不再受 quencher 抑制，發出螢光。
- 螢光累積：每個循環中產生的螢光與目標 DNA 擴增量成正比。
🧪 TaqMan 探針的設計組成
| 元件 | 位置 | 功能 |
|---|---|---|
| Reporter dye | 5′ 端 | 發出螢光訊號（如 FAM、VIC） |
| Probe sequence | 中段 | 與目標序列互補 |
| Quencher dye | 3′ 端 | 吸收報導分子的螢光以避免背景訊號（如 TAMRA、NFQ） |
Thermo Fisher 常用設計包含：
- Minor Groove Binder (MGB)：提升熔解溫度（Tm），讓探針更短更專一。
- Non-Fluorescent Quencher (NFQ)：提升背景控制與訊噪比。
✅ 優勢與特點
| 特點 | 說明 |
|---|---|
| 高專一性 | 探針需精準配對，僅檢測目標序列 |
| 多重反應（Multiplexing） | 可使用多種 Reporter 顏色，同時定量多目標 |
| 低背景螢光 | 無非特異性產物干擾（不像 SYBR Green） |
| 兼具定性與定量功能 | 同步偵測特異序列與反應效率 |
🔬 TaqMan vs. SYBR Green 比較
| 項目 | TaqMan Probe | SYBR Green |
|---|---|---|
| 專一性 | 高（探針+引子） | 中（僅引子） |
| 背景干擾 | 幾乎無 | 會偵測非特異性擴增或引子二聚體 |
| Multiplex | 可（不同 Reporter） | 不可 |
| 成本 | 較高（需探針設計合成） | 較低 |
| 使用情境 | 高準確需求，如診斷或多重檢測 | 一般基因表現分析、初步篩選 |
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ExcelTaq™ 2X Q‑PCR Master Mix (SYBR, no ROX)（貨號 TQ1100，200 次反應）
產品概述
ExcelTaq™ 2X Q‑PCR Master Mix（SYBR, 無 ROX）為一款「只需加引子與樣品模板，即可直接使用」的 realtime qPCR 主混合物。其配方內含熱啟動 Taq 聚合酶與專為雙股 DNA 檢測設計的 SYBR Green 螢光染料，可進行敏感、精準的擴增及即時量化。此主混合物還加入智慧藍色對比染料，可協助反應配置並降低移液誤差。也可視儀器需求搭配 ROX 參考染料使用。
主要特色
- 高靈敏度與強螢光訊號強度。
- 智慧藍色對比染料，便於視覺檢查反應配置。
- 與逆轉錄產生的 cDNA 反應體系具更佳相容性
- 低背景螢光，提升訊噪比。
保存與使用建議
- 避免光照照射，請保護於避光條件。
- 建議分裝以避免多次冷凍／解凍。
- 儲存條件：‑20 °C，最長保存 12 個月。
敏感度／相容性數據
- 該產品可在 cDNA 模板濃度範圍從 25 ng 到 1.49 fg 間進行即時擴增測定。
- 可直接使用來自逆轉錄反應體系的 2 µL cDNA 加入 20 µL qPCR 反應，展示出與市售品牌 A、B 相比更佳的相容性。
儀器相容性
可用於多款常見即時 PCR 儀器，包括但不限於 Thermo Fisher Scientific（Applied Biosystems 系列）、Bio‑Rad CFX 系列、Roche LightCycler 系列等。使用時若儀器內設置參考染料通道（passive dye channel），請務必取消選擇。
規格與構成
| 項目 | 規格 |
|---|---|
| 貨號 | TQ1100 |
| 容量 | 1 mL × 2 試劑盒 (200 反應) |
| 儲存條件 | ‑20 °C／避光保存 |
| 適用化學 | SYBR Green（無 ROX 參考染料） |
ExcelTaq™ 2X 即時定量 PCR 主混合液產品比較表
| 產品名稱 | 貨號 | 偵測化學原理 | 藍色對比染料（方便配置觀察） | ROX 參考染料 | 酵素活化時間 | 適用的 qPCR 程式 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ExcelTaq™ 2X Q-PCR Master Mix (SYBR, 無 ROX) | TQ1100 | SYBR | ✔ | ✘ | 10 分鐘 | 標準 |
| ExcelTaq™ 2X Q-PCR Master Mix (SYBR, 含 ROX) | TQ1110 | SYBR | ✔ | ✔ | 10 分鐘 | 標準 |
| ExcelTaq™ 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, 無 ROX) | TQ1200 | SYBR | ✔ | ✘ | 2 分鐘 | 快速與標準皆適用 |
| ExcelTaq™ 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, 含 ROX) | TQ1210 | SYBR | ✔ | ✔ | 2 分鐘 | 快速與標準皆適用 |
| ExcelTaq™ 2X Q-PCR Master Mix (TaqMan, 含 ROX) | TQ2110 | TaqMan | ✘ | ✔ | 10 分鐘 | 標準 |
說明：
- SYBR 檢測原理：利用 SYBR Green 螢光染料專一性結合雙股 DNA，適用於標準或快速模式的 qPCR。
- TaqMan 檢測原理：使用探針式螢光報導系統，提供更高專一性與多重檢測能力。
- 藍色對比染料（Blue contrast dye）：協助操作時目視辨識樣品是否加樣。
- ROX 參考染料：部分 qPCR 儀器（如 Applied Biosystems 系列）需要此染料做為螢光校正。
- 酵素活化時間：建議於 qPCR 程式前進行的熱啟動時間，用於激活 hot-start Taq polymerase。
以下資料來自AI產出，僅供參考
需要正常使用 ROX reference dye（ROX 參考染料） 的 qPCR 儀器主要是依賴 ROX 來做為 螢光強度的內部校正標準。這類儀器在每次讀取時會量測 ROX 發出的恆定螢光訊號，藉以補償因光源波動、光學路徑不一致或樣本體積差異所造成的螢光誤差。
✅ 需要正常 ROX Reference 的 qPCR 儀器（必須加入 ROX）
這些儀器需要在反應混合物中主動加入 ROX 染料，否則會導致內部校正錯誤、無法讀取或產生螢光偏差：
| 品牌 | 機型 |
|---|---|
| Applied Biosystems™ (Thermo Fisher) | 7500, 7500 Fast, 7300, StepOne™, StepOnePlus™, ViiA™ 7 |
| ABI 舊型儀器 | Prism® 7000、7900HT |
| Stratagene / Agilent（部分舊型） | Mx3000P、Mx3005P、Mx4000 |
👉 這類儀器通常會要求使用「High ROX」或「Low ROX」濃度版本的 Master Mix。
⚠️ 不需要 ROX 參考染料（或不建議使用）
這些儀器已有其他內部校正機制，不依賴 ROX：
| 品牌 | 機型 |
|---|---|
| Bio-Rad | CFX96, CFX384, CFX Opus 系列 |
| Roche | LightCycler® 480, LightCycler® 96 |
| Qiagen | Rotor-Gene Q |
| Thermo Fisher | QuantStudio™ 3, 5, 6, 7 系列（部分可開關 ROX 使用） |
| Eppendorf | Mastercycler® ep realplex |
| Analytik Jena | qTOWER³ 系列 |
🔍 如何判斷您的儀器是否需要 ROX？
你可以參考以下幾個指標：
| 判斷依據 | 說明 |
|---|---|
| 軟體是否有「Passive Reference」選項 | 若需選擇 ROX 作為校正染料，表示需加入 ROX |
| 儀器原廠技術規格 | 會明列需要 High ROX、Low ROX 或不需 ROX |
| 使用手冊 / 資料分析報告 | 若分析中需要參考螢光曲線進行校正，代表依賴 ROX |
Low ROX reference dye
以下是需要 Low ROX reference dye（低濃度 ROX 參考染料）校正的 qPCR 儀器型號列表，這些機器在反應中會偵測低濃度 ROX 螢光訊號進行校正，因此需搭配含有 Low ROX 的 Master Mix：
✅ 使用 Low ROX 的常見 qPCR 儀器
| 廠牌 | 儀器型號 |
|---|---|
| Applied Biosystems™ (Thermo Fisher) | |
| 🔹 7500 Real-Time PCR System | |
| 🔹 7500 Fast Real-Time PCR System | |
| 🔹 7300 Real-Time PCR System | |
| 🔹 StepOne™ Real-Time PCR System | |
| 🔹 StepOnePlus™ Real-Time PCR System |
這些機型為 傳統 ABI 平台的主流儀器，需要低濃度 ROX 進行「被動參考」校正（passive reference calibration）。
❗ 注意：
- 若使用 無 ROX 或 High ROX 的反應混合液 進行實驗，會導致這些儀器校正錯誤或螢光訊號不穩定。
- 某些 Thermo Fisher 的 Master Mix（如 PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix）採用 動態 ROX 適應技術，可相容於 High ROX、Low ROX 甚至無需 ROX 的儀器。