體外轉錄（In Vitro Transcription, IVT）是製造 mRNA疫苗、基因表現模板、或體外翻譯系統中常見的技術。這是一個在試管中利用細菌或病毒來源的RNA聚合酶（如 T7 RNA polymerase）將DNA模板轉錄成mRNA的過程。
🧬 IVT mRNA 體外轉錄合成流程（mRNA Synthesis Workflow）
1. DNA模板設計
DNA模板通常包含以下元素：
| 元件 | 功能 |
|---|---|
| T7 promoter | 啟動轉錄，為RNA聚合酶辨識點 |
| 5′ UTR | 協助mRNA穩定性與轉譯效率 |
| ORF（開放閱讀框） | 編碼蛋白質序列 |
| 3′ UTR | mRNA穩定性調控 |
| Poly(A) tail 或 A stretch | 增加mRNA穩定性與翻譯效率 |
2. 體外轉錄反應
使用酵素：T7 RNA polymerase
反應條件包含：
- 線性DNA模板（含T7 promoter）
- rNTPs（ATP, CTP, GTP, UTP）
- T7 RNA聚合酶
- 緩衝液（Mg²⁺、DTT等）
- RNase inhibitor（避免RNA降解）
3. 產物純化
轉錄後需去除：
- DNA模板（使用DNase）
- 未反應的rNTP、酶等（使用柱式純化或鋰鹽沉澱）
4. mRNA修飾（可選）
為提升mRNA穩定性與表現效率，常見修飾包括：
- 5′ Cap 加帽：提高mRNA穩定性並啟動轉譯
→ 可使用 ARCA cap analog 或酶法加帽（Vaccinia Capping Enzyme） - Poly(A) tail：增加轉譯效率與穩定性
→ 直接在DNA模板中設計polyA序列或用 polyA polymerase 加尾
5. mRNA分析與確認
- 電泳（Agarose 或 denaturing PAGE）
- 濃度測定（Nanodrop / Qubit）
- 完整性與大小確認
- 功能性測試（細胞轉染）
🔬 IVT mRNA 體外轉錄應用
| 應用領域 | 說明 |
|---|---|
| mRNA疫苗 | COVID-19 mRNA疫苗如Pfizer/BioNTech 和 Moderna |
| 蛋白質表現 | 在細胞內轉譯產生特定蛋白 |
| CRISPR 系統 | 製備sgRNA或Cas蛋白mRNA |
| 細胞重編程 | 將mRNA導入細胞調控表型 |
🧪【產品名稱】
IT1000 / IT1000 EZ-RNATM T7 高產量 RNA 合成試劑盒
規格： 50 次反應（50 rxn）
用途： 用於體外轉錄（IVT），從DNA模板合成高產量RNA。
🔬【產品特點】
- 適用於 T7 RNA polymerase 系統進行 in vitro transcription（體外轉錄）
- 適用於製備：
- mRNA疫苗
- sgRNA（CRISPR用途）
- RNA探針或標記RNA
- 所有元件皆經測試，無RNase污染
🧼【RNase污染防護建議】
為了保證實驗成功，維持RNase-free環境非常重要。建議：
✔ 實驗區域與耗材：
- 使用專門的工作區進行 RNA 實驗
- 使用專用的 pipette 和試劑
- 僅使用無菌、RNase-free的塑膠管與吸頭
✔ 個人操作：
- 配戴手套，並經常更換
- 操作時保持試劑瓶和管子緊閉，避免暴露空氣中 RNase
✔ 溶液處理：
- 所有水與溶液須經 DEPC 處理：
- 加入 0.1% (v/v) DEPC
- 室溫放置過夜
- 隔日高壓滅菌（autoclave）
Contents
| Components | Volume |
| T7 RNA Polymerase Mix | 100 μl |
| 10X T7 Reaction Buffer | 100 μl |
| NTP Premix (25 mM each) | 400 μl |
| Control DNA (0.5 μg/μl) | 10 μl |
| Lithium Chloride (7.5M) | 1 ml |
| Nuclease-Free Water | 1 ml |
Storage
-20°C for 12 months
🧪 產品資訊｜EzRNA™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (Ψ-UTP)
- 產品型號： IT1100
- 規格： 50 次反應（50 RXN）
- 儲存條件： -20°C 可保存 12 個月
- 應用： 利用 T7 啟動子序列從 DNA 模板合成 RNA
📦 組合內容（每組 50 反應）：
| 組件名稱 | 容量 |
|---|---|
| T7 RNA 聚合酶混合液 | 100 μl |
| 10X T7 反應緩衝液 | 100 μl |
| NTP (Ψ) 預混液 (25 mM each) | 400 μl |
| Control DNA（0.5 μg/μl） | 10 μl |
| 氯化鋰 (7.5M) | 1 ml |
| 無核酸酶水（Nuclease-Free Water） | 1 ml |
🌟 產品特色
- 💯 高產量： 2 小時內最高可得 150 μg RNA（37°C）
- 🧬 多功能性： 可合成短/長片段 RNA
- 🧪 預混 NTP (Ψ)： 降低操作時間與 pipetting 錯誤
- 🧢 可兼容 CleanCap® AG 試劑（加帽）
- 🧼 內含氯化鋰： 便於 RNA 純化
🔬 應用說明
- 適用於 T7 啟動子驅動之 DNA 序列的 RNA 合成
- 支援後續進行 Cap-0 或 Cap-1 加帽修飾
🧪 RNA 合成建議條件
📌 推薦反應配置（20 μl）：
| 組件 | 量 |
|---|---|
| 線性化 DNA 模板 | 1 μg |
| 10X 反應緩衝液 | 2 μl |
| NTP (Ψ) 預混液 | 8 μl |
| T7 RNA 聚合酶混合液 | 2 μl |
| 無核酸酶水加至總體積 | 20 μl |
備註：
- 除了酶液，其他成分須完全解凍，並在室溫操作組裝反應混合液。
- 可按比例放大反應體積。
- 必須在RNase-free 無污染環境中操作。
⏱️ 推薦反應條件：
- 37°C 孵育 2 小時
- 為達更高產量，可延長反應時間至 4–16 小時（依模板量與RNA片段長度調整）
🧼 RNA 純化方法選項
1. 氯化鋰（LiCl）沉澱法（適用於 >0.1 μg/μl 且長度 >300 nt RNA）：
- 加入 RNA 樣品的 ½ 體積 LiCl → 混合 → -20°C 孵育至少 1 小時
→ 4°C 下離心 14000×g、15 分鐘
→ 去除上清，70% 冰冷乙醇洗 2 次
→ 風乾並溶解 RNA 沉澱
2. 酸性酚-氯仿抽取 + 乙醇沉澱
- RNA/DNA 保留於水相，蛋白與游離核苷酸進入有機層
- 適用於樣品需更精確純化者
3. Spin Column 柱式純化
- 可使用矽膠柱搭配特殊 buffer 純化 RNA
- 也可搭配 oligo-dT 柱萃取 poly(A) 尾的 mRNA
🧪 RNA 品質評估方式
1. 電泳分析
- 建議使用變性條件（變性染料、變性膠體）
- 長鏈 RNA 易形成二級結構
- 建議使用 RNA 專用 marker（不可用 DNA ladder）
2. RNA 定量
- 使用吸光度 A260 定量（A260 × 40 μg/ml）
- 注意：蛋白、DNA 或游離核苷酸污染會影響吸光值 → 過度估計濃度
⚠️ 注意事項
- 僅供研究使用
- 不得用於人體或動物之診斷與治療
🧩 相關產品
| 產品名稱 | 功能 |
|---|---|
| RC1000 EzRNA RNA Capping System | RNA 加帽套件 |
| IT1000 EzRNA T7 高產 RNA 合成套件 | 不含修飾UTP |
| IT1200 EzRNA T7 RNA 合成套件 (me1Ψ-UTP) | 含 me1Ψ |
| RI1000 RNAok RNase 抑制劑 | 2000 U |
| RP1400 ExcelRT II 逆轉錄套件 | 100 反應 |
| TF1000 / TF3000 / TP5000 多種 DNA 聚合酶 | 高保真 PCR |
| TQ1110 / TQ2110 Q-PCR master mix | SYBR / TaqMan 版本 |
| DM2100 / NS1000 DNA ladder / 螢光染劑 | 電泳與膠染色用 |
🧪【產品名稱】
EzRNA™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (me1Ψ-UTP)
產品型號： IT1200
反應次數： 50 RXN
儲存條件： -20°C 保存 12 個月
應用： 利用 T7 啟動子驅動 DNA 模板合成修飾型 RNA，支援後續加帽（Cap-0、Cap-1）
📦【內容物一覽】
| 成分名稱 | 容量 |
|---|---|
| T7 RNA 聚合酶混合液 | 100 μl |
| 10X T7 反應緩衝液 | 100 μl |
| NTP (me1Ψ) 預混液（25 mM each） | 400 μl |
| Control DNA（0.5 μg/μl） | 10 μl |
| 氯化鋰（7.5M） | 1 ml |
| 無核酸酶水（Nuclease-Free Water） | 1 ml |
🌟【產品特色】
- ✅ 高產量： 約 2 小時 37°C 可產生最高 130 µg RNA
- 🧬 適用於短鏈與長鏈 RNA 轉錄產物
- 🧪 預混 NTP（含 me1Ψ）： 減少操作步驟與錯誤
- 🧢 支援 CleanCap® Reagent AG 加帽修飾
- 🧼 內含氯化鋰： 可用於 RNA 純化
🧬【RNA 合成操作條件】
🧾 建議反應組合（總體積 20 μl）：
| 成分 | 容量 |
|---|---|
| 線性化 DNA 模板 | 1 μg |
| 10X T7 反應緩衝液 | 2 μl |
| NTP (me1Ψ) 預混液 | 8 μl |
| T7 RNA 聚合酶混合液 | 2 μl |
| 無核酸酶水補至總體積 | 至 20 μl |
⚠️ 除了酶液，其餘試劑須先完全解凍，並在室溫操作混合
⏱️ 建議反應條件：
- 37°C 孵育 2 小時
- 如需更高產量，可延長至 4～16 小時
（依模板濃度與欲合成 RNA 長度作調整）
🧪 三款 EzRNA™ T7 高產 RNA 合成試劑盒差異比較表
| 項目 | IT1000 | IT1100 | IT1200 |
|---|---|---|---|
| 核苷酸類型 | 一般 NTP（ATP、CTP、GTP、UTP） | 含 Ψ-UTP（pseudouridine） | 含 me1Ψ-UTP（1-methyl-pseudouridine） |
| 修飾類型 | 無 | 去免疫化修飾 | 強效去免疫化＋高穩定修飾 |
| RNA 修飾效果 | 無修飾，容易觸發細胞免疫 | 減少 TLR7/8 活化，部分降低免疫反應 | 顯著降低免疫反應 且提升穩定性 |
| RNA 表現效率（in vivo） | 中 | 中～高 | 高 |
| 適用應用 | 一般 RNA 合成、探針、標記用途 | mRNA 疫苗開發、低免疫需求研究 | mRNA 疫苗、基因治療、細胞重編程等高階應用 |
| 加帽支援 | ✅ CleanCap® 相容 | ✅ CleanCap® 相容 | ✅ CleanCap® 相容 |
| 最大產量（2 小時@37°C） | 約 150 µg | 約 150 µg | 約 130 µg |
| NTP 預混型式 | 標準 NTP 預混 | Ψ-NTP 預混（含 pseudouridine） | me1Ψ-NTP 預混（含 1-methyl-pseudouridine） |
| 產品代碼 | IT1000 | IT1100 | IT1200 |
🧬 修飾核苷酸介紹
| 修飾名稱 | 結構基礎 | 功能說明 |
|---|---|---|
| Ψ（Pseudouridine） | U 的異構體 | 提升 RNA 穩定性，降低天生免疫識別（如 TLR7/8） |
| me1Ψ（1-Methyl-pseudouridine） | Ψ 的甲基化衍生物 | 更進一步降低免疫原性並提高翻譯效率 |