WES 主要回答「DNA 序列有哪些變異？」；RNA-seq 主要回答「哪些 RNA 被表現、表現多少，以及如何剪接？」 兩者分別觀察基因資訊與轉錄結果，能互相補充。

以下以常見的 short-read WES 與 bulk RNA-seq 為比較範圍。

WES：Whole Exome Sequencing，全外顯子定序

RNA-seq：RNA sequencing，RNA 定序

一、先條列詳述

1. 名稱與檢測對象
   • WES：Whole Exome Sequencing，全外顯子定序，分析 genomic DNA，主要富集蛋白編碼外顯子及部分鄰近區域。
   • RNA-seq：RNA sequencing，RNA 定序，分析樣本中的 RNA；常見流程會先將 RNA 反轉錄成 cDNA，再進行定序。
   • Exome 是外顯子體；Exosome 是外泌體，兩者意義不同。WES 的實際涵蓋範圍取決於 capture panel，並非所有外顯子都一定完整測到。
2. 兩者的共同點
   • 常使用 NGS，包含核酸萃取、品質檢查、建庫、定序與生物資訊分析。
   • 都需要足夠的定序資料與合適的分析方法；低品質樣本、比對困難及涵蓋不足，都會影響結果。
   • 都能提供基因層級的資訊，但測量的分子與結果意義不同。
3. WES 的重點：找出 DNA 變異SNP
   • 主要分析 SNV（單一核苷酸變異）與 small indel（小型插入／缺失）。
   • 特定流程也能分析部分 CNV（拷貝數變異），但能力取決於捕獲設計、涵蓋品質及演算法。
   • 不需要基因正在表現：即使某基因在採樣組織中幾乎沒有 RNA，仍可能從 DNA 找到它的變異。
   • 主要限制是目標區域以外的變異，例如深層 intron、調控區，以及部分結構變異；即使位於目標區域，也可能因涵蓋不足而漏檢。
4. RNA-seq 的重點：觀察轉錄表現與剪接
   • 可量化 gene／transcript expression，並比較組別間的 Differential Gene Expression，DGE。
   • 配合適當的建庫、讀長、深度與分析，可研究 alternative splicing、transcript isoforms、gene fusion 與 allele-specific expression。
   • 結果會隨組織、細胞組成、處理條件與採樣時間改變。
   • mRNA-seq 與 total RNA-seq 的涵蓋範圍不同；不能將所有 RNA-seq 都理解為會完整測到所有 RNA。
5. 兩者對 RNA splicing 的證據不同
   • WES 可找出捕獲範圍內、可能影響剪接的 DNA 變異，但不能僅憑變異就確認實際剪接結果。
   • RNA-seq 可透過 exon junction reads、exon 使用情形及 intron retention 等訊號，觀察樣本中的剪接現象。
   • 因此，「發現 splice-site 變異」與「觀察到異常剪接」是不同層次的證據；RNA-seq 是否能看見異常，也受基因表現量與定序深度影響。
6. Heat map 的解讀
   • RNA-seq 的常見 heat map：列是基因，欄是樣本，顏色代表轉換或標準化後的表現值。
   • 若使用 row Z-score，顏色表示「同一基因在不同樣本間的相對高低」，不能直接用來比較不同基因的絕對表現量。
   • Heat map 用於呈現模式與分群；差異表現是否顯著，仍需統計分析、biological replicates 與多重比較校正。
   • WES 也能製作 heat map，但內容可是變異狀態或 CNV，不等同 RNA 表現 heat map
7. 如何搭配使用
   • WES 提供候選 DNA 變異；RNA-seq 檢查相關基因的表現、剪接及受影響路徑。
   • 兩者結合能加強變異的生物學解釋，但DNA 變異與 RNA 改變同時存在，仍不足以單獨證明因果。
   • 兩者都不直接測量蛋白量；若研究問題涉及蛋白表現或功能，需再搭配 Western blot、proteomics 或功能實驗。

二、異同比較表

比較項目	WES	RNA-seq
完整名稱	Whole Exome Sequencing	RNA sequencing
主要觀察層級	DNA／基因變異	RNA／轉錄表現
核心問題	基因序列改變了什麼？	哪些基因被表現？表現多少？如何剪接？
起始材料	Genomic DNA	RNA
常見建庫方式	DNA 片段化、接上 adapters、外顯子捕獲富集	RNA 選擇或 rRNA depletion、反轉錄、cDNA 建庫；流程依方法而異
涵蓋範圍	Capture panel 設計的外顯子及部分鄰近區域	依建庫方法涵蓋 mRNA、部分非編碼 RNA 等
是否依賴基因表現	不需要該基因正在表現	需要有足夠 RNA 訊號才能可靠分析
主要結果	SNV、small indel、變異註解；部分流程可分析 CNV	Expression counts、DGE、isoforms、splicing；適當流程可分析 fusion
對剪接的資訊	找出可能影響剪接的 DNA 變異	觀察 RNA 的實際剪接訊號
變異分析限制	目標區域外、低涵蓋及難比對區域可能漏檢	未表現或低表現基因可能沒有足夠資料；RNA 變異結果不能直接取代 DNA 分析
組織／時間影響	一般體細胞的生殖系序列相對穩定；腫瘤、嵌合等情況需另外考量	高度受組織、細胞比例、處理與採樣時間影響
常見深度描述	目標區域 coverage，例如平均 × 數與達標比例	每樣本 reads／read pairs，以及有效比對與轉錄本涵蓋
主要品質重點	DNA 品質、on-target rate、涵蓋均勻度、重複率	RNA 完整性、rRNA 比例、比對率、基因涵蓋偏差及批次效應
常見分析輸出	FASTQ、BAM／CRAM、VCF、變異註解表	FASTQ、BAM／CRAM、count matrix、差異表現與剪接結果
常見視覺化	IGV 變異畫面、變異分布、CNV 圖	PCA、heat map、volcano plot、剪接 junction 圖
Heat map 常見意義	變異狀態、拷貝數或其他 DNA 特徵	基因表現模式、樣本相似度
是否直接測蛋白	否	否；RNA 表現量不等同蛋白量
主要盲點	多數非目標區域及部分結構變異	未表現轉錄本、低豐度訊號與方法未涵蓋的 RNA 類別

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