You're one in a million. ~在茫茫蛋白海中，只為與你相遇~
西方墨點法（Western blot）是用於檢測混合物中特定蛋白質的分析技術，主要透過蛋白質大小分離、轉移至固態載體，並使用特異性抗體來標記與視覺化目標蛋白。
以下是進行西方墨點法實驗的完整步驟指南：
步驟一：樣本製備 (Sample Preparation) 良好的樣本製備是實驗成功的基礎，能確保蛋白質被充分萃取並防止其降解。
- 將細胞培養盤置於冰上，用冰的 Tris 緩衝鹽水（TBS）清洗細胞。
- 加入冰的 RIPA 裂解緩衝液（內含蛋白酶抑制劑），用冷塑膠刮刀刮下細胞並轉移至預冷的離心管中。
- 在 4°C 下持續搖動 30 分鐘；必要時可進行超音波震盪，以確保細胞完全破裂並降低樣本黏稠度。
- 在 4°C 預冷的離心機中，以 16,000 x g 離心 20 分鐘，隨後將上清液轉移至乾淨的管中。
- 進行蛋白質濃度測定分析。
- 取等量蛋白質（例如 20 μg）加入等體積的 2x Laemmli 樣本加載緩衝液，然後在 95°C 下煮沸 5 分鐘使其變性。
步驟二：凝膠電泳 (Gel Electrophoresis) 此步驟利用 SDS-PAGE 依據蛋白質的分子量大小將其分離。
- 將等量的蛋白質樣本以及已知分子量的標記物（Ladder/Marker）載入 SDS-PAGE 凝膠的孔洞中。
- 先以 50 V 的電壓跑 5 分鐘，接著將電壓提高到 100–150 V，繼續跑約 1 小時直到完成。
步驟三：蛋白質轉漬 (Transfer) 將凝膠內分離好的蛋白質轉移到膜上，以便後續與抗體結合。
- 常見的轉漬膜有 PVDF 膜或硝化纖維素（NC）膜，前者較為堅固且允許重複探測（Re-probing），使用前需先浸泡甲醇。
- 組裝轉漬三明治，若採用效果較穩定的濕式轉漬（Wet transfer），其順序為：海綿 > 濾紙 > 凝膠 > 膜 > 濾紙 > 海綿（皆需浸泡過轉漬緩衝液），並確保三明治中沒有殘留氣泡。
- 在冷房中以 10 mA 恆定電流轉漬隔夜，或以 100 V 轉漬 30 分鐘至 2 小時（視蛋白質大小而定，較大蛋白質需要較長轉漬時間）。
- 可短暫使用 Ponceau S 染液檢查膜上的蛋白質轉漬品質是否均勻。
步驟四：封閉 (Blocking) 為防止抗體在膜上發生非特異性結合（造成背景雜訊），必須進行封閉處理。
- 常用的封閉液包括含 3% BSA 或 5% 脫脂奶粉的 TBST（含有 Tween 20 的 Tris 緩衝鹽水）。
- 將膜浸泡於封閉液中，在室溫下搖動 1 小時。
HyBlock 1 min Blocking Buffer
脫脂奶粉
步驟五：抗體培育 (Antibody Incubation)
- 一抗培育： 選擇合適的一抗（避免使用與樣本同物種的宿主抗體以免交叉反應），根據建議比例稀釋於封閉液中，在 4°C 下培育隔夜（或室溫 1-3 小時）。
- 清洗： 用 TBST 清洗膜 3-5 次，每次 5 分鐘，以洗掉未結合的一抗。
- 二抗培育： 加入帶有 HRP（辣根過氧化物酶）等標記的二抗，以放大訊號。在室溫下培育 1 小時。
- 清洗： 再次用 TBST 洗滌膜 3-5 次，每次 5 分鐘。
步驟六：影像擷取 (Imaging)
- 依據製造商指示，將化學發光受質（Chemiluminescent substrate）滴加至膜上與 HRP 反應發光。
- 推薦使用數位 CCD 相機影像系統來擷取訊號，它具有比傳統 X 光底片更好的線性動態範圍，能避免高強度條帶過度飽和，且更利於後續的精確定量。
步驟七：數據分析與定量 (Data Analysis and Quantification)
- 使用如 Image J 等影像分析軟體，圈選最大條帶的區域，讀取目標蛋白的訊號強度（IntDen），並務必扣除背景值。
- 進行校正（Normalization）： 為了消弭加樣誤差與轉漬效率的差異，必須將目標蛋白的強度與「載入對照組」（如 GAPDH、β-actin 等持家蛋白）或「總蛋白質（Total Protein）」的強度相除，算出校正後的相對表現量。
Trouble Shutting
